Xây dựng phương pháp LC-MS/MS xác định hàm lượng Difucosyllactose trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho trẻ sơ sinh

Folder Xem trước
Views 8
Last Updated 02/06/2026

Authors

Mạc Thị Thanh Hoa, Nguyễn Quang Hùng, Nguyễn Phạm Thành Chung, Vương Quỳnh Hoa, Lê Hồng Luyến, Cao Công Khánh

Abstract

Difucosyllactose (DFL) là một loại oligosaccharide trong sữa mẹ (HMOs) được thêm vào các sản phẩm sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh nhằm hỗ trợ sức khỏe đường ruột, phát triển hệ miễn dịch và thiết lập hệ vi sinh vật đường ruột có lợi cho trẻ sơ sinh. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật LC-MS/MS được sử dụng để xác định hàm lượng DFL trong sữa công thức. Mẫu sữa bột được hoàn nguyên với nước, ủ với enzyme amyloglucosidase 10 U/mL trong 30 phút và kết tủa protein bằng acetonitril 50%. Cột sắc ký Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) được sử dụng và duy trì ở nhiệt độ 55 oC trong quá trình phân tích, pha động gồm amoni format 10 mM và acetonitril (ACN) theo chương trình gradient. Mẫu được phát hiện bằng detector khối phổ với chế độ ion hóa phun điện tử âm và giám sát đa phản ứng (MRM) hai mảnh ion m/z 633.5 → 325.58 và 633.5 → 247.2 để định lượng và định tính. Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC và SMPR® 2021.006. Kết quả cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu tốt, khoảng tuyến tính từ 1-20 μg/mL. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp lần lượt là 4,80 - 5,12 μg/g và 11,2 - 17,1 μg/g. Phương pháp đã được áp dụng để phân tích hàm lượng DFL trong 24 mẫu sữa công thức thương mại được mua trên địa bàn Hà Nội. Kết quả cho thấy hàm lượng các DFL trong các mẫu dao động từ 15,6 - 214 mg/100g, với sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm tuổi sử dụng và các loại sản phẩm.

Keywords: Difucosyllactose, DFL, Lactodifucotetraose, LDFT, Human Milk Oligosaccharides, HMOs, LC-MS/MS.

References

[1] L. Bode, "Human milk oligosaccharides: Every baby needs a sugar mama," Glycobiology, vol. 22, no. 9, pp. 1147-1162, 2012.
[2] M. Dinleyici, J. Barbieur, E. C. Dinleyici and Y. Vandenplas, "Functional effects of human milk oligosaccharides (HMOs)”, Gut Microbes, vol. 15, no. 1, 2023.
[3] U.S. Food & Drug Administration, GRAS Notice For 2’-Fucosyllactose/Difucosyllactose (2’-FL/DFL), GRAS Notice No. 815, 2018.
[4] M. B. Azad, B. L. Rodriguez, and A. Rowan-Legg, "Human milk oligosaccharides: decoding their structural variability, health benefits, and relevance in infant nutrition," Nutrients, vol. 13, no. 1, p. 118, 2021.
[5] DSM-firmenich, “Human Milk Oligosaccharides (HMOs): delivering the benefits nature intended”, Product-information leaflet Glycare DFL [online]. Available at https://www.dsm-firmenich.com/en/businesses/health-nutrition-care/products/hmos/hmos-for-early-life/glycare-2fl-dfl.html. [Acessed: 19/02/2026]
[6] European Union, Commission Implementing Regulation (EU) 2021/50 authorising an extension of use and a change in the specifications of the novel food “2′-fucosyllactose/difucosyllactose mixture” and amending Implementing Regulation (EU) 2017/2470, Official Journal of the European Union, 22 January 2021.
[7] D. Turck, T. Bohn, J. Castenmiller, S. D. Henauw, K. I. Hirsch-Ernst, A. Maciuk, I. Mangelsdorf et al., “Safety of the extension of use of 2’-fucosyllactose/difucosyllactose (2’-FL/DFL) mixture and lacto-N- tetraose (LNT) as novel foods in food supplements for infants pursuant to Regulation (EU) 2015/2283”, EFSA Journal, 2022.
[8] Food Standards Australia New Zealand, Approval Report – Application A1265 - 2'-FL/DFL, LNT, 6'-SL sodium salt and 3'-SL sodium salt as nutritive substances in infant formula products, 2023.
[9] T. Benet, N. Frei, V. Spichtig, D. Cuany, and S. Austin, "Determination of seven human milk oligosaccharides in infant formula and adult nutritionals: First Action 2022.07," Journal of AOAC International, vol. 107, no. 2, pp. 286-302, 2024.
[10] A. El-Hawiet, Y. Chen, K. Shams-Ud-Doha, E. N. Kitova, P. I. Kitov, L. Bode et al., “Screening Natural Libraries of Human Milk Oligosaccharides Against Lectins Using CaR-ESI-MS”, Electronic Supplementary Material (ESI) for Analyst, Issue 2, 2018.
[11] N. T. H. Ngoc, M. T. T. Hoa, T. H. Son et al., "Method validation for simultaneous quantification of some Human Milk Oligosaccharides (HMOs) in dietary supplements by liquid chromatography tandem mass spectrometry", Vietnam Journal of Food Control, vol 4, no 1, pp. 73-84, 2021.
[12] A. S. Soares, B. R. C. Leite Junior, P. E. D. Augusto, C. A. Nogueira, and A. M. Ramos, "Ultrasound processing of amyloglucosidase: Impact on enzyme activity, stability and possible industrial applications," Acta Scientiarum Technology, vol. 43, p. e48929, 2021.
[13] S. S. Leeuwen, “Challenges and Pitfalls in Human Milk Oligosaccharide Analysis,” Nutrients, vol. 11, no. 11, pp. 2684, 2019.
[14] M. B. Murphy, Studies on the growth and production of amyolytic enzymes by Aspergillus spp., Master’s thesis, School of Biological Science, National Institute for Higher Education Dublin, Ireland, 1987.
[15] JECFA, Amyloglucosidase from Aspergillus nigers, var., FNP 52 Add 10, 2002.
[16] C. A. Remoroza, T. D. Mak, M. L. A. De Leoz, Y. A. Mirokhin and S. E. Stein, "Creating a mass spectral reference library for oligosaccharides in human milk," Analytical Chemistry, vol. 90, no. 13, pp. 7712-7720, 2018.
[17] J. Tan, H. H. Lee, L. Wong et al., "Simultaneous determination of neutral and acidic human milk oligosaccharides by LC-MS/MS," Applied Food Research, vol. 2, no. 2, p. 100153, 2022.
[18] Y. Bao, C. Chen and D. S. Newburg, "Quantification of neutral human milk oligosaccharides by LC- MS/MS," Analytical Biochemistry, vol. 433, no. 1, pp. 28-35, 2013.
[19] Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC International, 2016.
[20] Standard Method Performance Requirements (SMPR®) for Determination of Difucosyllactose (DFL) in Infant and Adult/Pediatric Nutritional Formula, AOAC International, 2021.
[21] The Human Metabolome Database, “Showing metabocard for Lactodifucotetraose (HMDB0006587), Predicted LC-MS/MS Spectrum - 20V, Negative”, 2021 [online] Available at https://hmdb.ca/metabolites/HMDB0006587. [Accessed: 20/02/2026]
[22] European Union, “Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 of 22 March 2021 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food- producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC”, Official Journal of the European Union, L180, pp. 84 – 109, 2021.
[23] S. Ahn and D. Chung, "Thermal characteristics of crystalline and amorphous 2'-fucosyllactose, a human milk oligosaccharide," (in eng), no. 1873-7072 (Electronic).
[24] J. F. Plows, P. K. Berger, R. B. Jones et al., "Longitudinal changes in Human Milk Oligosaccharides (HMOs) over the course of 24 months of lactation," Journal of Nutrition, vol. 151, no. 4, pp. 876-882, 2021.
[25] B. Soyyilmaz, M. H. Miks, C. H. Rohrig, M. Matwiejuk, A. Meszaros-Matwiejuk, and L. K. Vigsnaes, "The mean of milk: A review of Human Milk Oligosaccharide concentrations throughout lactation", Nutrients, vol. 13, no. 8, 2021.
[26] Novonesis, “Human milk oligosaccharides (HMOs) for early life nutrition” [online]. Available: https://www.novonesis.com/en/products?area=human-health&industry=early-life- nutrition&application=hmo. [Accessed: 04/02/2026].
[27] DSM, “Human milk oligosaccharides (HMOs) product brochure” [online]. Available: https://www.dsm.com/content/dam/dsm/human-nutrition/pdfs/HNC_product_brochure_HMOs.pdf. [Accessed: 04/02/2026].