Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương kỵ khí, sinh bào tử, có khả năng sinh độc thần kinh botulinum, có 4 serotype: A, B, E, F được biết đến có khả năng gây độc cho người. Từ năm 2020, hàng trăm ca đã lần đầu tiên được báo cáo ở Việt Nam. Các phương pháp nuôi cấy bao gồm xét nghiệm sinh học trên chuột thường mất nhiều tuần, dẫn đến việc bệnh nhân không được điều trị kịp thời. Do đó, các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (NAAT) sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu đã trở thành một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn bốn cặp mồi có kích thước 240 bp, 205 bp, 140 bp và 415 bp tương ứng với 4 gen đích mã hóa BoNT/A, /B, /E và /F để phân tách bằng phương pháp điện di agarose thông thường. Chu trình nhiệt được sửa đổi bằng việc kết hợp bước ủ và kéo dài cho phép hoàn thành phản ứng PCR đa mồi trong một giờ. Độ đặc hiệu phân tích của phương pháp cũng được đánh giá dựa trên hai chủng cùng chi Clostridium và sáu chủng khác chi Clostridium. Giới hạn phát hiện của phương pháp được xác định là 103 bản sao/ μL đối với các nhóm A, B, E với cả plasmid tinh khiết và DNA được chiết xuất từ nền mẫu. Tổng thời gian của quy trình đã thiết lập là 1,5 giờ, bao gồm cả điện di.
Multiplex PCR, Clostridium botulinum, BoNT/ A, /B, /E, /F
[1]. M. Lindström, R. Keto, A. Markkula, M. Nevas, S. Hielm, H. Korkeala , “Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material,” Applied and environmental microbiology, vol. 67, no. 12, pp. 5694–5699, 2001, doi: 10.1128/AEM.67.12.5694-5699.2001.
[2]. D. De Medici, F.Anniballi, G. M. Wyatt, M. Lindström, U. Messelhäusser, C. F. Aldus, E. Delibato, H. Korkeala, M. W. Peck, L. Fenicia, “Multiplex PCR for detection of botulinum neurotoxin-producing clostridia in clinical, food, and environmental samples,” Applied and environmental microbiology, vol. 75, no. 20, pp. 6457–6461, 2009, doi: 10.1128/AEM.00805-09.
[3]. D. A. Centurioni, C. T. Egan, M. J. Perry, “Current Developments in Diagnostic Assays for Laboratory Confirmation and Investigation of Botulism,” Journal of clinical microbiology, vol. 60, no. 4, pp. e0013920, 2022, doi: 10.1128/JCM.00139-20.
[4]. E. M. Elnifro, A. M. Ashshi, R. J. Cooper, P. E. Klapper, “Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology,” Clinical microbiology reviews, vol. 13, no. 4, pp. 559–570, 2002, doi: 10.1128/CMR.13.4.559.
[5]. T. J. Smith, K. M. Schill, C. H. D. Williamson, “Navigating the Complexities Involving the Identification of Botulinum Neurotoxins (BoNTs) and the Taxonomy of BoNT-Producing Clostridia,” Toxins, vol. 15, no. 9, pp. 545, 2023, doi: 10.3390/toxins15090545.
[6]. M. Lindström, H. Korkeala, “Laboratory diagnostics of botulism,” Clinical microbiology reviews, vol. 19, no. 2, pp. 298–314, 2006, doi: 10.1128/CMR.19.2.298-314.2006.
[7]. C. L. Hatheway, “Clostridium botulinum and other clostridia that produce botulinum neurotoxins,” Clostridium botulinum: Ecology and Control in Food, pp. 3-20, 1992, doi: 10.1201/9781315139623-1.
[8]. MW. Peck, “Biology and genetic analysis of Clostridium botulinum,” Advances in Microbial Physiology, vol. 75, no. 320, pp. 183–265, 2009, doi: 10.1016/S0065-2911(09)05503-9.
[9]. F. Anniballi, B. Auricchio, C. Woudstra, P. Fach, A. Fiore, H. Skarin, L. Bano, B. Segerman, R. Knutsson, D. De Medici, “Multiplex real-time PCR for detecting and typing Clostridium botulinum group III organisms and their mosaic variants,” Biosecurity and bioterrorism: biodefense strategy, practice, and science, vol. 11, pp. s207–s214, 2013, doi: 10.1089/bsp.2012.0084.
[10]. S. P. Pillai, K. K. Hill, J. Gans, T. J. Smith, “Real-time PCR assays that detect genes for botulinum neurotoxin A-G subtypes,” Frontiers in microbiology, vol. 15, 2024, doi: 10.3389/fmicb.2024.1382056.
[11]. R. A. Hutson, Y. Zhou, M. D. Collins, E. A. Johnson, C. L. Hatheway, H. Sugiyama, “Genetic characterization of Clostridium botulinum type A containing silent type B neurotoxin gene sequences,” The Journal of biological chemistry, vol. 271, no. 18, pp. 10786–10792, 1996, doi: 10.1074/jbc.271.18.10786.
[12]. J. J. Cordoba, M. D. Collins, A. K. East, “Studies on the genes encoding botulinum neurotoxin type A of Clostridium botulinum from a variety of sources,” Systematic and Applied Microbiology, vol. 18, pp. 13-22, 1995, doi: 10.1016/S0723-2020(11)80443-1.
[13]. Matt Lewis, “Agarose gel electrophoresis (basic method),” 2011. [Online]. Available: http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html.
[14]. Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Chang, S. Y., Landre, P. A., Abramson, R. D., & Gelfand, D. H., High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR methods and applications, Vol. 2, no. 4, pp. 275–287, 1993. https://doi.org/10.1101/gr.2.4.275.
[15]. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Application-Notes/at-rich-pcr-phusion-plus-app-note.pdf
[16]. Chen Y, Korkeala H, Aarnikunnas J, Lindstrom M., “Sequencing the botulinum neurotoxin gene and related genes in Clostridium botulinum type E strains reveals orfx3 and a novel type E neurotoxin subtype”, Journal of Bacteriol, 189, pp. 8643–8650, 2007. doi:10.1128/JB.00784-07.
[17]. Lee W, Riemann HJM. The genetic relatedness of proteolytic Clostridium botulinum strains. 64, 85–90, 1970.
[18]. Bohlin J, Eldholm V, Pettersson JH, Brynildsrud O, Snipen L. “The nucleotide composition of microbial genomes indicates differential patterns of selection on core and accessory genomes,” BMC Genomics, vol. 18, no. 151, 2017 doi:10.1186/s12864-017-3543-7.
[19]. Garafutdinov, R. R., Galimova, A. A., & Sakhabutdinova, A. R., “The influence of quality of primers on the formation of primer dimers in PCR,” Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, vol. 39, no.9, pp. 1251–1269, 2020, doi: 10.1080/15257770.2020.180335.
[20]. Haim M. Solomon and Timothy Lilly, Jr., "BAM Chapter 17: Clostridium botulinum," Bacteriological Analytical Manual, January 2001 Edition, U.S. Food and drug Adminitration. Available: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-17-clostridium-botulinum
[21]. Chu Hai Anh., Vu Minh, Tang Nga, Nguyen Thuy Tram, Le Huy Hoang, & Pham, Yen, “Development of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Clostridium botulinum serotypes E and F”, Molecular biology reports, Vol. 52, no.1, pp.29, 2024. https://doi.org/10.1007/s11033-024-10122-6.